Expressão e caracterização da glicoproteína D do HSV-1 geneticamente fusionada às oncoproteínas E6 e E7 do HPV-16 e HPV-18 (gDE7E6) em células de mamífero / Expression and characterization of the genetically fused HSV-1 glycoprotein D to E6 and E7 oncoproteins HPV-16 e HPV-18 (gDE7E6) in mammalian cells

O câncer cervical é um dos tipos de câncer mais comuns entre as mulheres, e a infecção persistente pelos HPV-16 e HPV-18 é responsável por 70% dos casos. As vacinas profiláticas disponíveis possuem alta eficácia na prevenção da infecção pelos tipos mais prevalentes de HPV. No entanto, este tipo de abordagem não beneficia mulheres que já apresentam lesões precursoras ou tumores cervicais avançados, e a busca por abordagens terapêuticas para esse tipo de câncer é considerada uma necessidade. A qualidade do antígeno representa um aspecto fundamental para o sucesso de vacinas terapêuticas baseadas em proteínas recombinantes. Neste sentido, os sistemas de expressão em células eucarióticas, como leveduras e células de mamíferos são considerados adequados para a produção de proteínas com aplicação biotecnológica. O objetivo principal deste trabalho contemplou a expressão das proteínas de fusão gDE7E6 do HPV-16 e do HPV-18 e a oncoproteína E7 do HPV-16 em células da levedura Pichia pastoris e expressão da gDE7E6 do HPV-16 e do HPV-18 em células de mamífero HEK293T e CHODG-44 para obtenção de antígenos purificados com futura aplicação em vacinas terapêuticas contra tumores associados ao HPV-16 e HPV-18. Os genes que codificam as proteínas gDE7E6 dos HPV-16 e HPV-18 e da E7 do HPV-16 foram clonados no vetor pPIC9K, os quais foram linearizados por digestão enzimática e utilizados na transformação da P. pastoris. A expressão das proteínas foi analisada nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas, no entanto, não foi observada a produção das proteínas no sobrenadante e nem no lisado celular. Diante desta constatação, iniciamos a expressão das proteínas gDE7E6 do HPV-16 e gDE7E6 do HPV-18 em células de mamíferos HEK293T e CHODG-44. As sequências genéticas das proteínas gDE7E6 do HPV-16 e do HPV-18 foram clonadas no vetor de expressão pNU1 e analisadas por digestão enzimática. Análises de SDS-PAGE e western blot demonstraram a expressão das proteínas gDE7E6 do HPV-16 e do HPV-18 em até 96 horas em células HEK293T. Em paralelo, realizamos a transfecção estável dos plasmídeos contendo as sequencias da gDE7E6 do HPV-16 e gDE7E6 do HPV-18 em células CHO-DG44. Com o intuito de aumentar a expressão das proteínas de interesse na população mista de CHODG-44, realizamos amplificação genômica com metotrexato (MTX), sendo possível observar aumento da expressão das proteínas, conforme aumento gradativo nas concentrações de MTX. Posteriormente, foram feitas tentativas para isolar um clone produtor das proteínas gDE7E6 HPV-16 e HPV-18, através de clonagem por diluição limitante e sistema automatizado, sendo possível isolar um clone para cada construção através de matriz semisólida, confirmado por western blot e citometria de fluxo. Apesar de demonstrar a expressão das proteínas de interesse em sistema de expressão baseado em células de mamífero, o rendimento obtido após a purificação por afinidade ao níquel foi extremamente baixo, o que dificulta a obtenção dos antígenos para fins vacinais

Cervical cancer is one of the most common cancers among women, and persistent infection with HPV-16 and HPV-18 accounts for 70% of the cases. Available prophylactic vaccines are highly effective in preventing infection by the most prevalent types of HPV. However, this type of approach does not benefit women who already have precursor lesions or advanced cervical tumors, and the search for therapeutic approaches to this type of cancer is considered a necessity. Antigen quality represents a key aspect for the success of therapeutic vaccines based on recombinant proteins. In this sense, expression systems based in eukaryotic cells such as yeast and mammalian cells are considered suitable for the production of proteins with biotechnological applications. The main objective of this work was to express the gDE7E6 fusion proteins HPV-16 and HPV-18 and the E7 oncoprotein HPV-16 in Pichia pastoris and expression of gDE7E6 HPV-16 and HPV-18 in mammalian cells HEK293T and CHODG-44 to obtain purified antigens with future applications in therapeutic vaccines against HPV-16 and HPV-18 associated tumors. The genes encoding the gDE7E6 proteins HPV-16 and HPV-18 and E7 HPV-16 were cloned into the pPIC9K vector, which were linearized by enzymatic digestion and used in the transformation of P. pastoris. Expression of the proteins was analyzed at 24, 48, 72 and 96 hours, however, the production of the proteins in the supernatant and in the cell lysate was not observed. In light of this finding, we initiated the expression of gDE7E6 proteins HPV-16 and HPV-18 in mammalian cells HEK293T and CHODG-44. The genetic sequences of gDE7E6 proteins HPV-16 and HPV-18 were cloned into the pNU1 expression vector and analyzed by enzymatic digestion. SDSPAGE and western blot analyzes demonstrated expression of gDE7E6 proteins HPV-16 and HPV-18 within 96 hours in HEK293T cells. In parallel, we performed stable transfection of plasmids containing gDE7E6 HPV-16 and HPV-18 sequences into CHODG44 cells. In order to increase the expression of the proteins in the mixed population of CHODG-44, we performed genomic amplification with methotrexate (MTX), and it was possible to observe an increase in protein expression, as a gradual increase in MTX concentrations. Therefore, attempts were made to isolate a clone producing gDE7E6 proteins HPV-16 and HPV-18 by limiting dilution and automated system, being possible to isolate one clone for each construct through a semisolid matrix, confirmed by western blot and flow cytometry. Despite observing protein expression in mammalian cell-based expression system, the yield obtained after nickel affinity purification was extremely low, which makes it difficult to obtain the antigens for vaccine purposes

Estudo dos mecanismos moleculares do reparo de quebra de duplas fitas no DNA mitocondrial / Study of the molecular mechanisms of double-strand break repair in mitochondrial DNA

O DNA está constantemente exposto a danos causados tanto por agentes endógenos quanto exógenos. Estes podem causar diferentes tipos de lesões incluindo modificações de bases e do açúcar, além de quebras de fitas simples ou duplas. As quebras de duplas fitas, quando comparadas às demais, constituem as mais citotóxicas e podem resultar em deleções no DNA e instabilidade genética. Deleções no DNA mitocondrial (mtDNA) causam diversas doenças e estão envolvidas no processo de envelhecimento. No núcleo, as quebras de duplas fitas no DNA podem ser reparadas por recombinação homóloga (HR), ligação de pontas não homólogas (NHEJ) e anelamento de fita simples (SSA). No entanto, em mitocôndrias de células de mamíferos, o reparo de quebras de duplas fitas ainda não foi completamente caracterizado. Experimentos in vitro usando extratos mitocondriais de células de roedores mostraram que estes são capazes de reparar essas quebras, no entanto pouco é sabido sobre quais proteínas são responsáveis por cada etapa de reparo, bem como sua implicação na manutenção da integridade do genoma mitocondrial. Sendo assim, nesse trabalho investigamos a localização e função mitocondrial das proteínas ATM, Rad51, Rad52, Ku70/86 e DNA-PKCs, que são sabidamente envolvidas em reparo de quebras de duplas fitas no núcleo. Para identificar essas proteínas em mitocôndrias de células de mamíferos, mitocôndrias foram isoladas a partir de células da linhagem HEK293T, usando centrifugação diferencial seguida por gradiente de Percoll. Para as proteínas de recombinação homóloga, ATM e Rad51, imunodetectamos isoformas semelhantes em todos os compartimentos celulares. Já para a proteína Rad52 o mesmo anticorpo imunodetectou duas bandas distintas na mitocôndria ao passo que no núcleo foram quatro. Além disso, verificamos que baixos níveis de proteína Rad52, induzidos pela expressão de shRNA (short hairping RNA) específico, resultam em diminuição do número de cópias de mtDNA bem como acúmulo de deleções no genoma mitocondrial. Para as proteínas de NHEJ, DNA-PKCs e a subunidade Ku70, identificamos isoformas semelhantes em todos os compartimentos celulares. Já para a subunidade 86 do heterodímero Ku70/86 o anticorpo detectou, somente em mitocôndrias, uma banda menor de 50 kDa, a qual difere na região N-terminal da subunidade detectada no núcleo (86 KDa). Experimentos de co-imunprecitação de proteínas mostraram que essa isoforma menor compõe o heterodímero mitocondrial juntamente com a subunidade 70 (mtKu70/50) e que esse interage com DNA ligase III mitocondrial. Nossos resultados também mostraram que a estabilidade proteica de mtKu70/50 é regulada por ATM. Tratamento das células com peróxido de hidrogênio, que induz quebras de duplas fitas, aumentou a associação do heterodímero mtKu70/50 com o mtDNA, de forma independente de aumento da concentração proteica intra-mitocondrial. Já a diminuição dos níveis proteicos de Ku, induzida através de shRNA, resultou em diminuição do número de cópias de mtDNA e acumulo de danos nesse genoma. Extratos mitocondriais de células knockdown para Ku apresentaram menor atividade de reparo NHEJ em um ensaio in vitro, sugerindo que o acúmulo de danos nestas células é provavelmente devido a deficiências na via de NHEJ. Em conjunto, nossos dados sugerem que tanto HR quanto NHEJ operam em mitocôndrias. Além disso, a via de NHEJ mitocondrial utiliza o heterodímero mitocondrial Ku70/50 o qual está envolvido na manutenção do mtDNA. Ademais, nossos resultados mostram uma grande conservação molecular e funcional entre as vias de reparo de NHEJ e HR no núcleo e na mitocôndria, o que reforça sua importância para a manutenção da estabilidade genômica mitocondrial e, provavelmente a função mitocondrial

DNA is constantly exposed to damaging agents from both endogenous and exogenous sources. These can cause different types of DNA lesions that include base and sugar modifications and single and double strand breaks. DNA doublestrand breaks (DSBs) are among the most cytotoxic DNA lesions, which can result in deletions and genetic instability. Deletions in the mitochondrial DNA (mtDNA) cause numerous human diseases and drive normal aging. DSBs in the nuclear DNA are repaired by non-homologous DNA end joining (NHEJ), homologous recombination (HR) or Single Strand Annealing (SSA). Yet, repair of DSBs in mammalian mitochondria has not been fully characterized. Mitochondrial extracts from rodent cells are proficient in ligating DNA ends in vitro, but little is known about which proteins are responsible for each enzymatic step and its implication in mitochondrial genome maintenance. Thus, we investigated mitochondrial localization and function of DSBR (double strand break repair) proteins ATM, Rad51, Rad52, the Ku70/86 heterodimer and DNA-PKCs.To identify DSBR proteins in mammalian mitochondria, highly purified mitochondria from HEK293T cells were isolated using differential centrifugation followed by Percoll gradient. For HR proteins, we detected similar isoforms for ATM and Rad51 proteins in all cellular compartments. Two mitochondriaspecific isoforms of Rad52 were detected, while the same antibody detected four isoforms in the nucleus. In addition, lower Rad52 protein levels, induced by specific shRNA expression, result in decreased mtDNA copy number and accumulation of deleted mitochondrial genomes. For NHEJ proteins, similar isoforms of DNA-PKcs and the Ku70 subunit were detected in all cellular compartments. On the other hand, antibodies against the Ku86 subunit detected a smaller band in mitochondrial extracts (50 KDa), lacking the N-terminal region of the canonical isoform detected in the nucleus (86 KDa). The mitochondrial Ku70/50 heterodimer interacts with mitochondrial DNA ligase III, suggesting a role in DSBR. Moreover, stability of the mtKu heterodimer is regulated by ATM. Hydrogen peroxide treatment, which induces DSBs, increases mtKu70/50 association with the mtDNA and cells with reduced Ku levels, also induced by shRNA transfection, have lower mtDNA copy number and accumulate mtDNA damage. Moreover, mitochondrial extracts from Ku knockdown cells show lower NHEJ repair activity in an in vitro assay, suggesting that damage accumulation in these cells is likely due to deficiencies in NHEJ. Together, our data suggest that both HR and NHEJ operate in mitochondria. Also, mtNHEJ requires the Ku heterodimer and is involved in mtDNA maintenance. Moreover, our results indicate that there is a significant molecular and functional conservation between NHEJ and HR repair pathways in the nucleus and in mitochondria, which reinforces their importance for maintenance of mitochondrial genomic stability and, likely mitochondrial function